La procedura di laboratoria del PraenaTest®

Esecuzione dell’esame esclusivamente in Germania secondo la legislazione tedesca ed europea

Solo il PraenaTest® originale viene sviluppato ed eseguito esclusivamente in Germania secondo la legislazione tedesca ed europea. Di seguito illustriamo la procedura di laboratorio secondo la tecnica random massively parallel sequencing (rMPS) presso il nostro laboratorio diagnostico di Costanza. Il risultato dell’esame è univoco e non rappresenta una valutazione del rischio.

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1. Estrazione del DNA libero circolante dal campione di sangue

In primo luogo, si isola il plasma sanguigno dal sangue materno. In secondo luogo, si estrae il DNA libero circolante dal plasma sanguigno. Tale DNA include sia quello materno che quello fetale, non separati.

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2. Determinazione della percentuale di DNA fetale libero circolante

Per eseguire correttamente un’analisi, è indispensabile che la percentuale di DNA fetale in commistione con il DNA materno sia pari ad almeno il 4% (nelle gravidanze gemellari almeno l’8%). In primo luogo, si determina la percentuale di DNA fetale libero circolante rispetto alla quantità totale. A tale scopo si utilizza un test proprietario (QuantYfeX®). Se la percentuale di cffDNA è troppo bassa, si raccomanda di eseguire un nuovo prelievo di sangue in un momento successivo della gravidanza.

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3. Sequenziamento del DNA (next generation sequencing)

Per sequenziare il DNA, i frammenti di DNA presenti in quantità limitata vengono preventivamente inseriti in una libreria genomica e poi amplificati. Successivamente, il DNA viene decodificato con apparecchi di analisi ultramoderni e con l’impiego della tecnica random massively parallel sequencing (rMPS). Per ogni campione vengono generate circa 15 milioni di sequenze.

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Analisi bioinformatica dei dati con il software PraenaTest® DAP.plus

 

4. Analisi bioinfomatica dei dati con il software PraenaTest® DAP.plus certificato CE

L’obiettivo dell’analisi è accertare se la quantità di sequenze del cromosoma ricercato supera il range normale presente in un normale corredo cromosomico euploide. A tale scopo, i 15 milioni di sequenze generate vengono in primo luogo classificati secondo criteri di qualità predefiniti utilizzando un genoma di riferimento umano. Di tutte queste sequenze, per l’analisi successiva possono esserne utilizzate circa 6 milioni. Tali sequenze sono caratterizzate  dal fatto di poter essere individuate ciascuna una sola volta in una determinata regione del genoma umano e di corrispondere al 100% al genoma di riferimento. Successivamente, si determina la quantità delle sequenze assegnate ad ogni cromosoma. (Fig. a sinistra)

 

Tenendo conto della quantità percentuale di sequenze assegnate ad ogni cromosoma rispetto alla quantità totale di 6 milioni di sequenze assegnate, si calcola poi il cosiddetto z-score. Lo z-score è un valore statistico che consente di determinare se il campione esaminato presenta un’anomalia cromosomica. Viene calcolato per ciascun cromosoma ricercato in un determinato campione. I valori limite dello z-score, sulla base dei quali si distingue fra un risultato positivo o negativo dell’esame, sono differenti per le trisomie 21, 18 e 13 a causa di fattori biologici e analitici. Per la eterminazione delle aneuploidie gonosomiche (sindrome di Turner, della tripla X, di Klinefelter e XYY) si utilizzano anche altri criteri di valutazione, pertanto il solo z-score non è indicativo.

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5. Formulazione tecnica del risultato del PraenaTest® e stesura del referto

Al termine dell’analisi, si formula tecnicamente il risultato, che viene documentato nel referto. L’esposizione della diagnosi e la connessa consulenza in genetica umana (regolamentata in Germania ai sensi del §10 della GenDG) sono di competenza del medico. In base al referto e nell’ambito di tutti gli altri riscontri clinici importanti, il medico responsabile può quindi escludere o viceversa confermare con un elevato grado di certezza la presenza di una delle anomalie cromosomiche ricercate.

Calcolo dello z-score sulla base della ricerca del cromosoma 21

 

In un campione con corredo cromosomico euploide possono essere assegnate all’incirca 76.000 sequenze al cromosoma 21. La quantità percentuale di queste sequenze rispetto alla quantità totale dei 6 milioni di sequenze è pari all’1,27% (Fig., campione 1). Se in un campione esaminato è presente una trisomia fetale 21, ossia una copia in più del cromosoma 21, sono all’incirca 79.000 le sequenze appartenenti al cromosoma 21. In questo caso, la quantità percentuale è pari all’1,32% (Fig., campione 2). Per calcolare lo z-score di un determinato cromosoma si utilizza ora la quantità percentuale posta in relazione con la quantità percentuale di un collettivo di riferimento (ossia una serie di campioni con corredo cromosomico euploide). Se tale quantità percentuale devia in una certa misura dalla mediana del collettivo di riferimento, è possibile accertare con un elevato grado di certezza una trisomia fetale 21 per il campione corrispondente. Valori dello z-score < 3 vengono riscontrati normalmente nelle gravidanze senza trisomia fetale 21. La distribuzione dei valori dello z-score di tali gravidanze corrisponde alla distribuzione normale di Gauß. Valori dello z-score ≥3 indicano invece la presenza di una trisomia fetale 21.

 

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Calcolo dello z-score del cromosoma 21

 

>>Studi clinici  

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