Der PraenaTest®-Laborprozess

Testdurchführung in Deutschland gemäß deutscher und europäischer Gesetzgebung

Der PraenaTest® wird in Deutschland gemäß deutscher und europäischer Gesetzgebung entwickelt und durchgeführt. Im folgenden beschreiben wir den Laborprozess gemäß der Methode des random massively parallel sequencing (rMPS) in unserem Diagnostiklabor. Das Ergebnis ist eindeutig und keine Risikobewertung.

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1. Gewinnung zellfreier DNA aus der Blutprobe

Zunächst wird aus dem mütterlichen Blut das Blutplasma isoliert. Dann wird aus dem Blutplasma die zellfreie DNA gewonnen. Diese stammt von Mutter und ungeborenem Kind und wird nicht voneinander getrennt.

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2. Bestimmung des Gehalts zellfreier fetaler DNA

Voraussetzung für eine erfolgreiche Analyse ist ein Gehalt an fetaler DNA  im Gemisch mit der maternalen DNA von mindestens 4% (bei Zwillingsschwangerschaften mindestens 8%). Zunächst wird der prozentuale Anteil an zellfreier fetaler DNA an der Gesamtmenge bestimmt. Dies erfolgt mittels eines proprietären Assays (QuantYfeX®). Ist der Anteil der cffDNA zu gering, wird eine erneute Blutentnahme zu einem späteren Zeitpunkt in der Schwangerschaft empfohlen.

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3. DNA-Sequenzierung (next generation sequencing)

Um die DNA sequenzieren zu können, werden die in geringer Menge vorliegenden DNA-Fragmente zuvor in einer genomischen Bibliothek angelegt und vervielfältigt. Dann wird die DNA mit hochmodernen Analysegeräten und mittels der Methode des random massively parallel sequencing (rMPS) entschlüsselt. Pro Probe werden etwa 15 Millionen Sequenzen erzeugt.

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Bioinformatische Datenauswertung mit PraenaTest® DAP.plus Software

 

4. Bioinformatische Datenauswertung mit CE-gekennzeichneter PraenaTest® DAP.plus Software

Ziel ist festzustellen, ob die Menge an Sequenzen für das jeweils untersuchte Chromosom den Normbereich überschreitet, der bei einem euploiden, d.h. normalen Chromosomensatz gefunden wird. Dazu werden zunächst die generierten 15 Millionen Sequenzen nach festgelegten Qualitätskriterien unter Nutzung eines humanen Referenzgenoms sortiert. Etwa 6 Millionen Sequenzen können daraus für die nachfolgende Analyse verwendet werden. Diese Sequenzen zeichnen sich dadurch aus, dass sie jeweils nur einmal an einer bestimmten Region des humanen Genoms zu finden sind und hundertprozentig mit dem Referenzgenom übereinstimmen. Anschließend wird die Menge der zugeordneten Sequenzen pro Chromosom ermittelt. (Abb. links)

 

Unter Berücksichtigung des prozentualen Anteils der zugeordneten Sequenzen pro Chromosom an der Gesamtmenge der 6 Millionen zugeordneten Sequenzen wird dann der sogenannte z-score errechnet. Der z-score ist ein statistischer Wert anhand dessen bestimmt wird, ob die untersuchte Probe eine Chromosomenstörung aufweist. Er wird für das jeweils untersuchte Chromosom einer Probe berechnet. Die Grenzwerte der z-scores, anhand derer ein positives von einem negativen Testergebnis unterschieden wird, sind für die Trisomien 21, 18 und 13 aufgrund biologischer und analytischer Faktoren unterschiedlich. Für die Bestimmung gonosomaler Aneuploidien (Turner-, Triple X-, Klinefelter- und XYY-Syndrom) werden weitere Bewertungskriterien herangezogen, so dass der z-score allein nicht aussagekräftig ist.

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5. Fachliche Interpretation des PraenaTest® Ergebnisses und Erstellung der Ergebnismitteilung

Abschließend wird das Ergebnis fachlich interpretiert und in der Ergebnismitteilung dokumentiert. Die Diagnosestellung sowie die damit verbundene humangenetische Beratung (in Deutschland gemäß §10 GenDG) unterliegt dem Arztvorbehalt. Der verantwortliche Arzt kann daher auf Basis der Ergebnismitteilung sowie im Kontext aller anderen relevanten klinischen Befunde das Vorliegen einer der untersuchten Chromosomenstörungen mit hoher Sicherheit entweder ausschließen oder bestätigen.

Berechnung des z-scores basierend auf der Untersuchung des Chromosoms 21

 

In einer Probe mit euploidem Chromosomensatz können ungefähr 76.000 Sequenzen dem Chromosom 21 zugeordnet werden. Der prozentuale Anteil dieser Sequenzen an der Gesamtmenge der 6 Millionen Sequenzen beträgt 1,27% (Abb., Probe 1). Liegt in einer untersuchten Probe eine fetale Trisomie 21, d.h. eine zusätzliche Kopie des Chromosoms 21 vor, sind es jedoch ungefähr 79.000 Sequenzen, welche zum Chromosom 21 gehören. Der prozentuale Anteil beträgt in diesem Fall 1,32% (Abb., Probe 2). Für die Berechnung des z-scores für ein bestimmtes Chromosom wird nun der prozentuale Anteil mit dem jeweiligen prozentualen Anteil eines Referenzkollektivs (d.h. eines Sets von Proben mit euploidem Chromosomensatz) in Relation gesetzt. Weicht er in einem bestimmten Maß vom Median des Referenzkollektivs ab, kann mit hoher Sicherheit für die betreffende Probe eine fetale Trisomie 21 festgestellt werden. z-scores < 3 werden typischerweise bei Schwangerschaften ohne fetale Trisomie 21 gefunden. Die Verteilung der z-scores solcher Schwangerschaften entspricht der Gauß’schen Normalverteilung. z-scores ≥3 weisen auf das Vorliegen einer fetalen Trisomie 21 hin.

 

z-score Berechnung des Chromosoms 21

z-score Berechnung des Chromosoms 21

 

>>Klinische Studien

 

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